饲用纤维素酶研究进展

纤维素是地球上最廉价、最丰富的可再生资源。全世界每年的植物体生成量高达1500亿吨干物质，其中纤维素及半纤维素的总量为850亿吨。但由于纤维素具有水不溶性的高结晶构造，其外围又被木质素包围着，要把它水解成可利用的葡萄糖相当困难，所以到目前为止仍未能得到很好地利用。随着世界人口的骤增，资源面临短缺的危机。如何有效的利用纤维资源对解决环境污染、食品短缺及能源危机等具有重大现实意义。利用微生物产生的纤维素酶(cellulase)来分解和转化纤维素则是纤维素利用的有效途径，故对纤维素酶的研究越来越引起人们的重视。纤维素酶于1904年在蜗牛消化液中最先被人们所发现，1945年在微生物中发现了此酶，此后，纤维素酶的研究和应用便逐步受到世界各国的关注。纤维素酶作为饲料添加剂始于20世纪70年代，我国也从这一时期开始进行初步的纤维素酶研究工作，近二十年来，进行了开发性研究工作，并应用到饲料工业中，取得了一定的效果。下面主要就纤维素酶的结构、功能特性、应用研究现状及前景作一综述。
1  纤维素酶的组成与分类
    纤维素酶是指能降解纤维素的一类酶的总称，是一个由多种水解酶组成的复杂酶系，主要来自于真菌和细菌。根据各酶功能的不同主要分为三类：1、葡聚糖内切酶（1，4-β-D-glucan glucanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase，E.C3.2.1.4，来自于真菌简称为EG；来自于细菌简称为Len），这类酶一般作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1，4糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。2、葡聚糖外切酶（1，4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1,4-β-D-glucanase，E.C3.2.1.91，来自于真菌简称Cbh；来自于细菌简称Cex），这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β-1，4糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase）。3、β-葡聚糖苷酶（β-1，4-glucosidase, E.C3.2.1.21，简称BG），这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。
2  纤维素酶的分子结构与功能
    纤维素酶分子普遍具有类似的结构，均由催化结构域（catalytic domains,CD）、纤维素结合结构域（cellulose-binding domains, CBD）和连接桥（linker）三部分组成。（1）催化结构域：呈球形，主要体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。内切酶的活性位点位于一个开放的裂口（cleft）中，它可结合在纤维素链的任何部位并切断纤维素链。外切酶的活性位点位于一个长环状通道中，它只能从纤维素链的非还原性末端切下纤维二糖。（2）纤维素结合结构域：CBD在纤维素酶中位于肽链的氨基端或羧基端，通过连接桥与催化结构域相连。1995年，Tomme（1995）根据CBD分子大小及氨基酸的相似性将已知的CBD分成了10个家族，大部分的CBD位于家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。人们推测，CBD可能通过芳香环与葡萄糖环的堆积力吸附到纤维素上，由CBD上其余的氢键形成残基与相邻葡萄糖链从纤维素表面脱离开来，以利于催化区的水解作用。但有一些纤维素酶并没有CBD，如热纤梭菌是依靠纤维素酶系中的纤维小体(celluosome)吸附纤维素的。（3）连接桥：连接桥主要是保持CD和CBD之间的距离，也可能有助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体。细菌纤维素酶的连接桥富含脯氨酸、苏氨酸，而真菌纤维素酶的连接桥富含甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸。细菌纤维素酶的CBD与CD夹角为135度，而真菌为180度；细菌纤维素酶有两个酶切位点可将CBD与连接桥分别切去，而真菌纤维素酶一般只有一个酶切位点可将CBD与连接桥一同切去。
3  纤维素酶的来源和生产
3.1 微生物来源
3.1.1 真菌源
    所有能分解晶体纤维素的真菌，均能或多或少的分泌纤维素酶，所以纤维素酶的真菌性来源非常广泛。目前研究和生产中采用的菌种大多是木霉、曲霉和青霉等。有人综述了纤维素酶的来源，认为绿色木霉的得率最高。目前研究的热点之一是通过对已知纤维素酶产生菌进行诱变，以增加产酶微生物菌种，国内外已有很多这方面的研究报道，如Mandels等（1971）通过绿色木霉QM6a获得了QM9123，使活力提高一倍；上海植生所纤维素酶组采用野生木霉As3.3002和拟康氏木霉，经物理、化学因子诱变，获得了高活力菌株Ea3-967和N2-78。利用基因工程手段也是提高纤维素酶产量和质量的重要方法。通过克隆出真菌的纤维素酶基因，将其与高效表达基因的启动子和染色体起始位点融合则可表达，并且表达量增加；同时利用基因工程手段对纤维素酶分子进行改造，增加其活性并提高耐受性。
3.1.2 细菌源
    能分解纤维素的细菌如纤维粘菌、热纤梭菌及纤维杆菌等亦能分泌纤维素酶。但由于细菌分泌的纤维素酶量少（低于0.1g/L），且产生的酶属胞内酶或粘附在细胞壁上，难以进行工业化生产，所以很少用细菌作为纤维素酶的生产菌种。不过近年来国外利用纤维杆菌深层通气培养生产纤维素酶效果较好。
3.2 动物性来源
    反刍动物能消化纤维类饲料，主要由于其瘤胃内的微生物能分泌纤维素酶。因此可以利用瘤胃液获得纤维素酶的粗酶制剂。国内外已进行了这方面的研究工作，但还没能应用到规模化生产中来。
3.3 工业生产
纤维素酶的都是通过发酵生产的。目前所用菌种主要是绿色木霉、李氏木霉、根霉、青霉、反刍动物（瘤胃细菌、真菌）、嗜纤细菌、产黄单孢菌、侧孢菌等，其中绿色木霉应用最广。纤维素酶是一类胞外酶，从培养物滤液中很容易得到，它又属于诱导酶，在诱导物存在下才能大量产生。许多不溶性纤维素、可溶性纤维素衍生物、一些低聚糖及某些单糖和二糖均可作为诱导物。研究发现，在分批培养物发酵过程中，起初pH值最好是自然下降到3.0~3.5，再加以控制以防止pH降低，消耗纤维素后自然上升，这样有利于酶的大量分泌。连续培养时保持pH=5.0可提高酶产量，因为低pH会抑制菌的生长。以前一些国家采用固体曲法生产纤维素酶，但此法难于监控，不利于现代化流水作业。因此现多采用液体深层发酵。在此基础上又出现了流加培养法、分批发酵法、连续发酵法、二次发酵法及细胞循环法等。新近又在研究混合微生物发酵法。因为不同真菌的纤维素酶系在各组分均衡性方面有互补的现象，因此如将几类菌混合在一起发酵，寻求使它们均能大量分泌纤维素酶的发酵条件和方法，就可以生产出优质高效的混合纤维素酶。
4  纤维素酶的作用机理
4.1 纤维素酶的降解机理
    Reese在1980年提出了C1-CX假说，该假说认为由于天然纤维素的特异性必须以不同的酶协同作用才能将其分解。协同作用一般认为是内切葡萄糖酶首先进攻纤维素的非结晶区，形成外切纤维素酶需要的新的游离末端，然后外切纤维素酶从多糖链的非还原端切下纤维二糖单位，β-葡萄糖苷酶再水解纤维二糖单位，形成葡萄糖。一般认为，协同作用与酶解底物的结晶度成正比，当酶组分的混合比例与霉菌发酵液中各组分比相近时，协同作用最大，不同菌源产生的内切与外切酶之间也具有协同作用。
目前最易为人们所接受的纤维素酶降解作用机理为：
4.2 纤维素酶的营养作用机理
4.2.1 摧毁植物细胞壁，释放胞内养分
    植物细胞内的营养物质由植物细胞壁包裹，植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶组成。纤维素酶可在半纤维素酶、果胶酶等协同作用下破坏细胞壁，使细胞内容物释放出来，以有利于进一步降解，提高吸收率，同时也增加了非淀粉多糖的消化进而改善了高纤维饲料的利用率。
4.2.2 补充动物内源酶的不足，剌激内源酶的分泌质的吸收
    纤维素酶具有维持小肠绒毛形态完整，促进营养物质吸收的功能。
4.2.3 缓解或消除饲料抗营养因子的影响
    果胶、半纤维素、β-葡聚糖及戊聚糖能部分溶解于水中，并产生粘性，增加了动物胃肠道内容物的粘度，对内源酶来说是一个屏障，降低了营养物质的消化吸收。而补充纤维素酶后，能在半纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖等的协助下将纤维素、半纤维素、果胶、戊糖等大分子物质降解为单糖和寡糖，从而降低粘稠度，促进内源酶的扩散，增加养分的消化吸收。
4.2.4 促进小肠对营养物

5  纤维素酶在畜牧生产上的应用
5.1 应用方法
    由于植物细胞壁成分非常复杂，单一纤维素酶并不能很好的降解植物纤维素。在实际生产中通常将纤维素酶与半纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶等组成复合酶制剂，以取得更好的应用效果。目前，主要有两种应用方法：（1）体外酶解法：把纤维素酶与秸杆或其他粗饲料拌匀后，在一定的温度、湿度和pH值下堆积或密封发酵一定时间后，晾干或直接饲喂动物；（2）体内酶解法：把纤维素酶以添加剂的形式加入饲料中拌匀后饲喂动物，借助动物消化道的内环境而发挥作用。
5.2 应用效果
    大量试验研究表明，饲料中添加纤维素酶对各种动物的饲喂效果十分显著。尹清强等在荷斯坦奶牛日粮中添加50g/头的纤维素酶，使产奶量提高了8.9%，饲料转化率提高10%。前苏联学者在绵羊日粮中加入0.25%的纤维素酶，可明显提高日增重、粗纤维消化率和羊毛产量。许梓荣等（1999）在含30%麸皮的肉鸡日粮中添加β-葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶，使日增重提高9.79%，饲料转化率改善4.76%，干物质、粗纤维、粗脂肪和粗灰分的消化率分别提高10.58%、25.90%、21.76%和7.12%。秦江帆等（1996）在肉仔鸡日粮中提高富含纤维的麦麸比例，并添加纤维素酶研究其效果，发现纤维素酶对肉仔鸡的生长尤其是前期有明显的促进作用。徐奇友等（1998）在13~20周育成期蛋鸡日粮（含35%麸皮）中添加0.5%纤维素酶，使增重提高6.29%，饲料转化率提高2.46%。Kee等（1985）在含20%麸皮的肉鸡日粮中添加0.08%的纤维素酶，显著降低了饲料消耗，改善了饲料转化率。Qureshi等（1980）在大麦基础饲料中添加0.08%的纤维素酶显著提高了肉鸡日增重。王鹏健等用含纤维素酶的复合酶制剂进行罗非鱼喂养试验，结果发现两个试验组增重分别比对照组提高18.6%和15.1%。此外，有人发现纤维素酶对治疗草食动物胃肠疾病也有一定效果。陈侠甫等认为，纤维素酶对马急、慢性消化不良、便秘、牛前胃迟缓、瘤胃膨胀、瘤胃积食等疾病有明显疗效。
6  纤维素酶在畜牧生产中应用存在的问题
6.1 添加量问题
    虽然国内外有关纤维素酶应用的研究报道很多，但添加水平和结论并不一致。对于不同酶活性的产品、不同动物种类、不同生理阶段以及不同饲料品种的适宜添加量并没有明确，因此在实际应用中往往出现用量不当而影响应用效果。
6.2 单独使用效果不明显
    植物细胞壁是一个极其复杂的体系，主要由纤维素搭成骨架，其中填充有大量半纤维素、果胶等物质，还有不少的木质素等，这些物质相互交融混合构成了极其复杂的结构体系，纤维素酶单独使用难以将细胞壁彻底裂解，表现出效果不明显。若搭配半纤维素酶、果胶酶等酶种使用则能取得较好效果。
6.3 纤维素酶对畜禽消化生理影响
    饲喂纤维素酶后对于不同种类、不同发育阶段动物消化酶系的变化及纤维素酶添加后对内源酶活力影响的研究不够，这样就难以合理地根据畜禽内源酶状况补充其他酶组成复合酶制剂应用，以改变纤维素酶单独使用效果不佳的状况。
6.4 稳定性问题
    纤维素酶是一种微生物制剂，对温度、湿度、酸、碱等敏感，处理不当易失活，而对其进行稳定化处理的研究还不够，也是导致饲用效果不稳定的因素。
7  应用前景
    随着人们对纤维素酶研究工作的深入，纤维素酶必将在食品、饲料、环境保护、能源和资源开发等各个领域中发挥越来越大的作用。如何加大对纤维素酶研究和开发的科技投入，改变目前纤维素酶生产规模小、工艺设备落后，菌种产酶性能不佳、稳定性差、生产成本高、技术水平低下的现状，应尽快采用各种高新技术，加大纤维素酶应用研究工作的深度，这必将使纤维素酶得到更广泛的应用，从而极大地促进我国畜牧业的发展。
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